一、操作前準備：保障實驗基礎

1. 環境與設備校驗

環境要求 ：

溫度：15-30℃（恒定±1℃）

濕度：≤80%

遠離震動源（如離心機、搖床）

開機校驗 ：

啟動后執行自動光學校準 （≥30分鐘預熱）

使用標準校準板驗證孔間信號一致性（CV值＜5%）

2. 耗材與試劑選擇

專用耗材 ：

僅使用原廠認證96孔板 （如MicroAmp™ Optical Plate）

匹配光學級封膜 （防止蒸發與透光干擾）

試劑規范 ：

預混試劑提前解凍（冰上操作），避免反復凍融

反應體系推薦：20-50μL （低體積需校準加樣精度）

二、標準化操作流程

Step 1 實驗設計與軟件設置

創建新程序：

命名實驗（例：靶標分子_202405）

選擇檢測通道（FAM/VIC/ROX等，支持5通道同步）

設置反應程序：

Step 2 加樣與上機

分區操作防污染 ：

試劑配制區（潔凈臺） → 樣本處理區（生物安全柜） → 擴增分析區（獨立空間）

反應體系構建：

模板DNA：≤100 ng/孔

引物/探針：按預混試劑說明書濃度添加

推薦體系：

預混試劑 10 μL + 引物探針 2 μL + 模板 3 μL + ddH?O 5 μL  

上機操作：

孔板輕震離心（避免氣泡）

按A1→H12順序 放置，確保孔位與軟件匹配

Step 3 運行監控與數據分析

實時監控：

軟件界面查看擴增曲線 與熒光閾值（ΔRn）

異常孔位標記（如信號跳躍、無擴增）

結果解讀：

Ct值判定 ：閾值線設定在指數擴增期（建議自動計算）

熔解曲線 ：單峰=特異性擴增，多峰=引物二聚體

三、關鍵注意事項與排障方案

四、日常維護與校準

每周維護 ：

用無絨布蘸70%乙醇清潔樣品槽

檢查散熱濾網（積塵降低制冷效率）

五、安全與合規聲明

本操作需在BSL-1級實驗室 環境下進行：

穿戴實驗服、手套及護目鏡

廢棄耗材按《實驗室生物安全手冊》分類處置

設備僅用于科研與質檢用途